2D Western Blots

Anders als im klassischen 1D Western Blot werden beim 2D Western Blot die Proteine nach Molekulargewicht und Eigenladung getrennt und dann immunochemisch nachgewiesen. Dadurch sind Isoformen und/oder post-translationalen Modifikationen des Proteins of Interest (Target) nachweisbar, die im 1D Western Blot nicht detektierbar wären.

Da eine Vielzahl von Proteinen nicht über die Menge sondern über post-translationale Modifikationen (Red/Ox, Phosphorylierungen, Glykosylierungen) reguliert werden, birgt diese Analyse extrem viel Potential.

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Host Cell Protein Analyse

Biotherapeutische Produkte basieren zunehmend auf rekombinant hergestellten Proteinen. Die Produktion der Proteine erfolgt in sogenannten Wirtszellen (Host Cells), die neben den rekombianten Proteinen auch eine Vielzahl von wirtseigenen Proteinen herstellen (Host Cell Proteins, HCPs). Die wirtseigenen Proteine stellen damit eine Verunreinigung dar und müssen im Produktionsprozess erkannt und entfernt werden.

Der Nachweis von HCPs erfolgt meist mittels spezifischer anti-HCP-Antikörper. Die zweidimensionale Western Blot HCP Analytik (2D WB HCP Analytik) kann die Leistungsfähigkeit eines Anti-HCP-Antikörpers beurteilen. Dabei wird verglichen, wie hoch der Deckungsgrad zwischen dem Wirtsproteom und dem durch den Antikörper detektierten Proteom ist, die nicht erkannten HCPs können identifiziert werden. Des Weiteren kann die 2D-HCP Methodik analysieren, wieviele Verunreinigungen im Produktionsprozess auftauchen.

Für die sichere Erkennung des Gesamtproteins auf der Membran verwenden wir die Fluoreszenzmarkierung mit T-Rex.

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Quantitative Western Blots im Hochdurchsatz

Der Western Blot beruht auf der Trennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht (SDS-PAGE) und seltener nach der Eigenladung (IEF Gels). Nach Transfer der Proteine auf eine Membran wird das Protein of Interest (Target) immunologisch mit einem spezifischen Antikörper nachgewiesen.

Um exakte Aussagen über eine Regulation (Zu- oder Abnahme an Menge des Targets unter verschiedenen Bedingungen) machen zu können, muss das nachweisbare Target-Signal auf das zu diesem Zeitpunkt auf der Membran befindliche Gesamtprotein bezogen werden.

Für die genaue Quantifizierung der Target-Signale verwenden wir die patentierte Smart Protein Layers Technologie. Unter Verwendung der NH DyeAGNOSTICS eigenen VELUM 1D Gele können bis zu 50 Proben pro Blot analysiert werden.

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ELISA

Der Enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA) ist ein schnelles und einfaches immunologisches Nachweisverfahren. Das/ die Protein(e) von Interesse werden mit Hilfe spezifischer Antikörper nachgewiesen und quantifiziert. Anders als im Western Blot erfolgt die Analytik ohne vorherige Auftrennung der Proteine direkt in Mikrotiterplatten. Der Nachweis erfolgt i.d.R. colorimetrisch oder ist Fluoreszenz-basiert. Es kommen direkte, Sandwich- oder kompetitive ELISAs zum Einsatz.

Wir unterstützen Sie in der Auswahl geeigneter ELISA-Varianten sowie bei der Etablierung der passenden Protokolle.

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Assay Entwicklung

Sie sind an einem bestimmten Protein interessiert, es gibt aber keine kommerziellen Antikörper oder es fehlt ein etabliertes Protokoll für einen immunologischen Nachweis? Unsere Assay-Entwicklung unterstützt Sie umfassend:

• • Entwicklung poly- und monoklonaler Antikörper
• • Entwicklung von ELISA- und Western Blot-Protokollen
• • ggf. Überführung in das Lateral Flow Format (bis zur

  qualitätsgesicherten large-scale Produktion)

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